Ce este CRISPR?

Tehnologia CRISPR este un instrument simplu dar puternic pentru editarea genomilor. Permite cercetătorilor să modifice ușor secvențele ADN și să modifice funcția genelor. Numeroasele sale aplicații potențiale includ corectarea defectelor genetice, tratarea și prevenirea răspândirii bolilor și îmbunătățirea culturilor. Cu toate acestea, promisiunea sa ridică și preocupări etice.

În utilizarea populară, „CRISPR” (pronunțat „crisper”) este scurt pentru „CRISPR-Cas9”. CRISPR sunt întinderi de ADN specializate. Proteina Cas9 (sau „asociată CRISPR”) este o enzimă care acționează ca o pereche de foarfece moleculare, capabile să taie șuvițe de ADN.

Tehnologia CRISPR a fost adaptată de la mecanismele naturale de apărare ale bacteriilor și arhaea (domeniul microorganismelor unicelulare). Aceste organisme folosesc ARN derivat de CRISPR și diferite proteine ​​Cas, inclusiv Cas9, pentru atacuri ale virusurilor și ale altor corpuri străine. Acestea o fac în primul rând prin tăierea și distrugerea ADN-ului unui cotropitor străin. Când aceste componente sunt transferate în alte organisme, mai complexe, permite manipularea genelor sau „editarea”.

Până în 2017, nimeni nu știa cu adevărat cum arată acest proces. Într-o lucrare publicată pe 10 noiembrie 2017, în revista Nature Communications, o echipă de cercetători condusă de Mikihiro Shibata de la Universitatea Kanazawa și Hiroshi Nishimasu de la Universitatea din Tokyo au arătat cum arată când un CRISPR este în acțiune pentru prima dată timp. [Un nou GIF impresionant arată CRISPR Chewing up DNA]

CRISPR-Cas9: Jucătorii-cheie

CRISPRs: "CRISPR „înseamnă„ grupuri de repetări palindromice scurte cu distanțare regulată. „Este o regiune specializată a ADN-ului cu două caracteristici distincte: prezența repetițiilor și distanțatoarelor de nucleotide. regiunea.Espațiatorii sunt biți de ADN care se întrepătrund între aceste secvențe repetate.

În cazul bacteriilor, distanțierii sunt luați din viruși care atacau anterior organismul. Ele servesc ca o bancă de amintiri, care permite bacteriilor să recunoască virusurile și să combată atacurile viitoare.

Acest lucru a fost demonstrat pentru prima dată de Rodolphe Barrangou și o echipă de cercetători la Danisco, o companie de ingrediente alimentare. Într-o lucrare din 2007 publicată în revista Science, cercetătorii au folosit Streptococcus thermophilus bacterii, care sunt frecvent întâlnite în iaurt și în alte culturi lactate, ca model. Ei au observat că, în urma unui atac de virus, noi distanțiere au fost încorporate în regiunea CRISPR. Mai mult decât atât, secvența ADN a acestor distanțieri a fost identică cu părți ale genomului virusului. De asemenea, au manipulat distanțierii prin scoaterea lor sau prin introducerea de noi secvențe ADN virale. În acest fel, au fost capabili să modifice rezistența bacteriilor la atacul unui virus specific. Astfel, cercetătorii au confirmat că CRISPRs joacă un rol în reglarea imunității bacteriene.

ARN CRISPR (crRNA): Odată ce un distanțier este încorporat și virusul atacă din nou, o parte din CRISPR este transcrisă și procesată în ARN CRISPR, sau „crRNA”. Secvența de nucleotide a CRISPR acționează ca un șablon pentru a produce o secvență complementară de ARN monocatenar. Fiecare crRNA constă dintr-o repetiție de nucleotide și o porție de distanțare, conform unei recenzii din 2014 de Jennifer Doudna și Emmanuelle Charpentier, publicate în revista Science.

Cas9: Proteina Cas9 este o enzimă care taie ADN-ul străin.

Proteina se leagă în mod obișnuit la două molecule de ARN: crRNA și alta numită tracrNA (sau "crRNA trans-activator"). Cei doi apoi îl ghidează pe Cas9 către site-ul țintă unde va face tăierea acestuia. Această întindere de ADN este complementară unei întinderi cu 20 de nucleotide a crRNA.

Folosind două regiuni separate, sau „domenii” pe structura sa, Cas9 taie ambele șuvițe ale dublei helixuri a ADN-ului, făcând ceea ce este cunoscut ca o „pauză cu două cateni”, conform articolului Science din 2014..

Există un mecanism de siguranță încorporat, care asigură că Cas9 nu taie nicăieri într-un genom. Secvențe scurte de ADN cunoscute sub numele de PAM („motive protospacer adiacente”) servesc ca etichete și stau adiacente secvenței ADN țintă. Dacă complexul Cas9 nu vede o PAM lângă secvența de ADN țintă, nu se va tăia. Acesta este un motiv posibil pentru care Cas9 nu atacă niciodată regiunea CRISPR în bacterii, potrivit unui review din 2014 publicat în Nature Biotechnology.

CRISPR-Cas9 ca instrument de editare a genomului

Genomele diferitelor organisme codifică o serie de mesaje și instrucțiuni în secvențele ADN ale acestora. Editarea genomului presupune schimbarea acestor secvențe, modificând astfel mesajele. Acest lucru se poate face prin introducerea unei tăieri sau rupturi în ADN și trucarea mecanismelor naturale de reparare a ADN-ului unei celule în introducerea modificărilor dorite. CRISPR-Cas9 oferă un mijloc în acest sens.

În 2012, două reviste de cercetare pivot au fost publicate în revistele Science și PNAS, care au contribuit la transformarea CRISPR-Cas9 bacteriană într-un instrument simplu, programabil de editare a genomului.

Studiile, realizate de grupuri separate, au concluzionat că Cas9 ar putea fi direcționat să taie orice regiune a ADN-ului. Acest lucru s-ar putea face prin simpla schimbare a secvenței de nucleotide a crRNA, care se leagă de o țintă ADN complementară. În articolul despre știință din 2012, Martin Jinek și colegii lor au simplificat în continuare sistemul prin fuzionarea crRNA și tracrNA pentru a crea un singur "ARN-ghid". Astfel, editarea genomului necesită doar două componente: un ARN ghid și proteina Cas9.

„Operațional, proiectați o întindere de 20 de perechi de baze [nucleotide] care se potrivesc cu o genă pe care doriți să o editați”, a spus George Church, un profesor de genetică la Harvard Medical School. Se construiește o moleculă de ARN complementară celor 20 de perechi de baze. Biserica a subliniat importanța asigurării că secvența de nucleotide nu se găsește decât în ​​gena țintă și nicăieri altundeva în genom. „Atunci ARN-ul, plus proteina [Cas9] vor tăia - ca o pereche de foarfece - ADN-ul de pe acel loc și, ideal, nicăieri altundeva”, a explicat el.

Odată ce ADN-ul este tăiat, mecanismele naturale de reparație ale celulelor pornesc și funcționează pentru a introduce mutații sau alte modificări ale genomului. Există două moduri în care se poate întâmpla acest lucru. Conform proiectului Huntington’s Outreach de la Stanford (Universitatea), o metodă de reparare implică lipirea celor două tăieturi. Această metodă, cunoscută sub denumirea de „unire finală neomologă”, tinde să introducă erori. Nucleotidele sunt introduse sau șterse accidental, rezultând mutații, care ar putea perturba o genă. În a doua metodă, pauză este fixată prin completarea golului cu o secvență de nucleotide. Pentru a face acest lucru, celula folosește un șir scurt de ADN ca șablon. Oamenii de știință pot furniza șablonul ADN-ului ales, scriind astfel orice genă pe care o doresc sau corectând o mutație.

Utilitate și limitări

CRISPR-Cas9 a devenit popular în ultimii ani. Church notează că tehnologia este ușor de utilizat și este de aproximativ patru ori mai eficientă decât cel mai bun instrument de editare a genomului anterior (numit TALENS).

În 2013, primele rapoarte privind utilizarea CRISPR-Cas9 pentru a edita celulele umane într-un cadru experimental au fost publicate de cercetătorii de la laboratoarele Church și Feng Zhang ale Broad Institute din Massachusetts Institute of Technology și Harvard. Studiile care folosesc modele in vitro (de laborator) și animale ale bolii umane au demonstrat că această tehnologie poate fi eficientă în corectarea defectelor genetice. Exemple de astfel de boli includ fibroza chistică, cataracta și anemia Fanconi, potrivit unui articol de recenzie din 2016 publicat în revista Nature Biotechnology. Aceste studii deschid calea pentru aplicații terapeutice la om.

„Cred că percepția publică a CRISPR este foarte concentrată pe ideea utilizării editării de gene clinic pentru a vindeca boala”, a spus Neville Sanjana, din New York Genome Center și un profesor asistent de biologie, neuroștiință și fiziologie la Universitatea New York. „Este fără îndoială o posibilitate interesantă, dar aceasta este doar o mică bucată.”

Tehnologia CRISPR a fost aplicată și în industria alimentară și agricolă pentru a inginerii culturi probiotice și pentru a vaccina culturile industriale (de exemplu, iaurt) împotriva virusurilor. De asemenea, este utilizat în culturi pentru a îmbunătăți randamentul, toleranța la secetă și proprietățile nutritive.

O altă aplicație potențială este de a crea unități de gene. Acestea sunt sisteme genetice, care cresc șansele ca o anumită trăsătură să treacă de la părinți la urmași. În cele din urmă, de-a lungul generațiilor, trăsătura se răspândește prin populații întregi, potrivit Institutului Wyss. Conducerea genelor poate ajuta la controlul răspândirii bolilor, cum ar fi malaria, sporind sterilitatea în rândul vectorului bolii - femeie Anopheles gambiae țânțari - conform articolului 2016 Biotechnology Nature. În plus, unitățile genice ar putea fi utilizate și pentru eradicarea speciilor invazive și pentru inversarea rezistenței la pesticide și erbicide, conform unui articol din 2014 de Kenneth Oye și colegii săi, publicat în revista Science.

Cu toate acestea, CRISPR-Cas9 nu este lipsit de dezavantajele sale.

"Cred că cea mai mare limitare a CRISPR este că nu este eficientă sută la sută", a spus Church. Mai mult decât atât, eficiența de editare a genomului poate varia. Conform articolului din 2014 Science Doudna și Charpentier, într-un studiu realizat în orez, editarea genelor a avut loc la aproape 50 la sută dintre celulele care au primit complexul Cas9-ARN. În timp ce, alte analize au arătat că, în funcție de țintă, eficiența de editare poate ajunge la 80% sau mai mult.

Există, de asemenea, fenomenul de "efecte off-țintă", în cazul în care ADN-ul este tăiat în alte locuri decât ținta dorită. Aceasta poate duce la introducerea mutațiilor neintenționate. Mai mult, Church a menționat că, chiar și atunci când sistemul se reduce la țintă, există șansa de a nu obține o editare precisă. El a numit acest „vandalism genomic”.

Stabilirea limitelor

Numeroasele aplicații potențiale ale tehnologiei CRISPR ridică întrebări cu privire la meritele și consecințele etice ale manipulării genomului.

În articolul științific din 2014, Oye și colegii lor indică potențialul impact ecologic al utilizării unităților de gene. O trăsătură introdusă s-ar putea răspândi dincolo de populația țintă la alte organisme prin încrucișare. Unitățile de gene pot reduce, de asemenea, diversitatea genetică a populației țintă.

Modificarea genetică a embrionilor umani și a celulelor reproducătoare, cum ar fi spermatozoizii și ouăle, este cunoscută sub numele de editare a liniei germinale. Deoarece modificările acestor celule pot fi transmise generațiilor următoare, utilizarea tehnologiei CRISPR pentru a face modificări ale liniilor germinale a ridicat o serie de preocupări etice.

Eficacitatea variabilă, efectele off-target și modificările inexacte prezintă riscuri pentru siguranță. În plus, există multe lucruri necunoscute încă comunității științifice. Într-un articol din 2015 publicat în Science, David Baltimore și un grup de oameni de știință, eticieni și experți juridici notează că editarea de linii germinale ridică posibilitatea consecințelor neintenționate pentru generațiile viitoare "deoarece există limite pentru cunoașterea noastră de genetică umană, interacțiuni genă-mediu, și căile bolii (inclusiv interacțiunea dintre o boală și alte afecțiuni sau boli la același pacient). "

Alte preocupări etice sunt mai nuanțate. Ar trebui să facem schimbări care ar putea afecta fundamental generațiile viitoare fără a avea acordul lor? Ce se întâmplă dacă utilizarea de editare a liniei germene de la a fi un instrument terapeutic la un instrument de îmbunătățire pentru diverse caracteristici umane?

Pentru a rezolva aceste preocupări, Academiile Naționale de Științe, Inginerie și Medicină au creat un raport cuprinzător, cu ghiduri și recomandări pentru editarea genomului.

Deși Academiile Naționale solicită prudență în continuarea editării liniei germinale, ele subliniază „precauția nu înseamnă interdicție”. Ei recomandă ca editarea liniei germinale să se facă numai pe gene care duc la boli grave și numai atunci când nu există alte alternative de tratament rezonabile. Printre alte criterii, ele subliniază necesitatea de a avea date despre riscurile și beneficiile pentru sănătate și necesitatea supravegherii continue în timpul studiilor clinice. De asemenea, recomandă urmărirea familiilor pentru mai multe generații.

Cercetare recentă

Au fost multe proiecte de cercetare recente bazate în jurul CRISPR. "Ritmul descoperirilor de cercetare de bază a explodat, datorită CRISPR", a declarat biochimistul și expertul CRISPR, Sam Sternberg, liderul grupului de dezvoltare tehnologică la Caribou Biosciences, cu sediul în California, din Berkeley, California, care dezvoltă soluții CRISPR pentru medicină, agricultură și cercetare biologică.

Iată câteva dintre cele mai recente descoperiri:

• În aprilie 2017, o echipă de cercetători a lansat cercetări în revista Science că au programat o moleculă CRISPR pentru a găsi tulpini de virusuri, cum ar fi Zika, în ser sanguin, urină și salivă.
• Pe 2 august 2017, oamenii de știință au dezvăluit în jurnalul Nature că au îndepărtat un defect al bolilor de inimă într-un embrion folosind cu succes CRISPR.
• Pe 2 ianuarie 2018, cercetătorii au anunțat că ar putea să oprească ciupercile și alte probleme care amenință producția de ciocolată folosind CRISPR pentru a face plantele mai rezistente la boli.
• Pe 16 aprilie 2018, cercetătorii au actualizat CRISPR pentru a edita mii de gene simultan, potrivit cercetărilor publicate de revista BioNews.

Raportări suplimentare ale Alinei Bradford, colaborator.

Resurse aditionale

• Broad Institute: o cronologie a lucrărilor pivotante asupra CRISPR
• Știri de inginerie și biotehnologie genetică: CRISPR-Cas9 Îmbunătățit 10000-Fold de Nucleotide sintetice
• Institut larg: întrebări și răspunsuri despre CRISPR